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免疫組化操作步驟
第一節(jié) 免疫組化操作步驟及抗原修復(fù)(供參考)
一、免疫組化操作步驟
(一)、儀器設(shè)備

1、 18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或用微波爐

2、 水浴鍋

(二)、試 劑

1、 PBS緩沖液(pH7.2―7.4)

2、 0.01mol/L檸檬酸鈉緩沖液(CB,pH6.0,1000ml)

3、 3%甲醇―H2O2溶液:用30% H2O2 和80%甲醇溶液配制

4、 風(fēng)裱劑:

a. 甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.0–9.5)等量混合

b. 油和TBS(PBS)配制

5、 TBS/PBS pH9.0–9.5,適用于熒光纖維鏡標(biāo)本;pH7.0-7.4適合光學(xué)纖維標(biāo)本

(三)、操作流程

1、 脫蠟和水化:脫蠟前應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘

a. 組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘,更換二甲苯后在浸泡10分鐘

b. 無水乙醇中浸泡五分鐘

c. 95%乙醇中浸泡五分鐘

d. 75%乙醇中浸泡五分鐘

2、 抗原修復(fù):用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片

二、抗原修復(fù)(免疫組化石蠟切片)

用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片需要抗原修復(fù)。

福爾馬林固定的組織有可能破壞了原來組織的抗原結(jié)構(gòu),蛋白多肽發(fā)生交聯(lián),導(dǎo)致部分抗原表位封閉,結(jié)合位點(diǎn)減少,所以需要抗原修復(fù),以暴露原來的抗原表位,達(dá)到充分顯露抗原,以不出現(xiàn)明顯脫片現(xiàn)象為佳。

抗原修復(fù)的幾種常用方法(供參考)

1、 微波爐加熱:

在微波爐里加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液(pH6.0)至沸騰后將組織芯片放入,斷電,間隔5-10分鐘,反復(fù)1-2次。根據(jù)玻片情況可參考采用微波加熱“3-5-3法”3分鐘溫火沸騰后靜止5分鐘,再溫火沸騰3分鐘即可。

適用的抗原:來源于人、大鼠、小鼠的組織標(biāo)本;來源于其他動(dòng)物種屬的組織標(biāo)本。

2、 沸熱修復(fù):

電爐或水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖液(pH6.0)至95℃左右,放入組織芯片加熱10-15分鐘。

3、 高壓熱修復(fù):

在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01m枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0).蓋上不銹鋼鍋蓋,但不能鎖定。將玻片置于金屬染色架上,緩慢加壓,使玻片在緩沖液中浸泡五分鐘,然后將蓋子鎖定,小閥門將會(huì)升起來。10分鐘后除去熱源,置入涼水中,當(dāng)小閥門沉下去后打開蓋子。此方法適用于較難檢測(cè)或核抗原的抗原修復(fù)。(骨及軟骨組織的標(biāo)本最好選擇較溫和的微波加熱修復(fù)) 。

4、 酶消化方法:

常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預(yù)熱37℃,消化時(shí)間約為5-30分鐘。

適用于被固定遮蔽的抗原:包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.c-erB-2.LCA.LN.等。

三、石蠟切片免疫組化染色步驟

1、三步法(以SP試劑盒為例)

- 石蠟切片脫蠟至水

- 蒸餾水沖洗,PBS浸泡5分鐘,如果采用抗原修復(fù),可在此步后進(jìn)行

- 3% H2O2 室溫孵育5~10分鐘,以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性,PBS沖洗,2分鐘×3次

- 5~10%正常山羊血清封閉,室溫孵育10分鐘。傾去血清,勿洗,滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液,37℃孵育1~2小時(shí)或4℃過夜

- PBS沖洗,2分鐘×3次

- 滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗(1%BSA-PBS稀釋),37℃孵育10~30分鐘;或滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液,37℃或室溫孵育10~20分鐘

- PBS沖洗,2分鐘×3次

- 滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素(PBS稀釋),37℃孵育10~30分鐘;或第二代辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液,37℃或室溫孵育10~20分鐘

- PBS沖洗,2分鐘×3次

- 顯色劑顯色(DAB或AEC)

- 自來水充分沖洗,復(fù)染,脫水透明、封片

- 如果必要,可選用avdin封閉內(nèi)源性生物素

2.SABC法

- 脫蠟、水化

- PBS洗2次各5分鐘

- 用蒸餾水或PBS配制新鮮的3% H2O2 ,室溫封閉5-10分鐘,用蒸餾水洗3次

- 抗原修復(fù)

- PBS洗5分鐘

- 滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘,甩去多余液體

- 滴加Ι抗50ul,室溫靜置1小時(shí)或4℃過夜或37℃1小時(shí)

- PBS洗3次各2分鐘

- 滴加生物素化Ⅱ抗,20℃-37℃ 20分鐘

- PBS洗3次各2分鐘

- 滴加試劑SABC 20℃-30℃ 20分鐘

- PBS洗4次各5分鐘

- DAB顯色:試劑盒或自配顯色劑顯色

- 脫水、透明、封片、鏡檢

四、冰凍切片的免疫組化染色步驟

- 速凍組織

- 冰凍切片4~8μm,冰凍切片后如不染色,必須吹干,儲(chǔ)存低溫冰箱內(nèi),或進(jìn)行短暫預(yù)固定后儲(chǔ)存于-20℃冰箱

- 室溫放置30分鐘后,入4℃丙酮固定10分鐘,也可根據(jù)需要選擇其他的固定方式

- PBS沖洗,5分鐘×3次

- 用3%過氧化氫孵育5~10分鐘,消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性

- PBS沖洗,5分鐘×3次

- 下接石蠟切片免疫組化染色操作步驟(滴加一抗開始)

第二節(jié) 免疫組化抗原熱修復(fù)的技術(shù)要點(diǎn)(供參考)
一、抗原熱修復(fù)溫度和時(shí)間的關(guān)系

我們?nèi)粘9ぷ髦兴褂玫慕M織固定液福爾馬林會(huì)引起組織蛋白內(nèi)或蛋白之間的亞甲基發(fā)生橋連,具體過程如下:

第一步:基本反應(yīng)福爾馬林和氫反應(yīng)形成新的化合物;

第二步:基本反應(yīng)福爾馬林和氫反應(yīng)形成新的亞甲基橋。

上述反應(yīng)的結(jié)果導(dǎo)致許多抗原決定簇被封閉,而加熱可以水解該橋連使抗原被激活。影響抗原熱修復(fù)的兩個(gè)最關(guān)鍵的因素是溫度和時(shí)間,有人將這兩種因素對(duì)抗原修復(fù)的影響總結(jié)為下面的公式: 抗原熱修復(fù)的有效性=加熱溫度(T) × 加熱時(shí)間(t)。

也就是說當(dāng)我們修復(fù)時(shí)的溫度越低則需要修復(fù)的時(shí)間就越長(zhǎng);反過來當(dāng)修復(fù)溫度增高時(shí)修復(fù)的時(shí)間可以適當(dāng)?shù)乜s短,才能使抗原決定簇完全暴露,這種反比的關(guān)系從MBI單克隆抗體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果“表1”中也可以清楚地看出。

表1 時(shí)間和溫度對(duì)染色的影響
  • 時(shí)間(分鐘)
  • 100℃
  • 80℃
  • 60℃
  • 5×2
  • + + +
  • 5×6
  • + + + +
  • + + +
  • 5×10
  • + + + +
  • +
  • 10小時(shí)
  • + +

如果修復(fù)強(qiáng)度不夠,免疫組織化學(xué)染色所顯示的只能是修復(fù)后暴露的部分抗原決定簇,而不是組織所含的全部抗原。這樣的染色結(jié)果可能會(huì)非常弱,或出現(xiàn)假陰性,即使是陽(yáng)性結(jié)果,充其量只能起到定性的作用,不能適應(yīng)今后對(duì)免疫組化進(jìn)行定量的需要。這就給我們?cè)\斷中定量指標(biāo)的應(yīng)用帶來困難,例如用來測(cè)定耐藥的指標(biāo)。

二、組織固定時(shí)間和所需的抗原熱修復(fù)的關(guān)系

大量的實(shí)驗(yàn)表明,固定時(shí)間越長(zhǎng)的標(biāo)本,它所形成的橋連就越緊密,抗原就越難以被激活,所需要的修復(fù)強(qiáng)度也就越強(qiáng)。有意思的是隨著固定時(shí)間的延長(zhǎng),組織中蛋白對(duì)溫度的耐受也相應(yīng)增高,這可能就是我們對(duì)固定時(shí)間長(zhǎng)的標(biāo)本加大修復(fù)強(qiáng)度的理論基礎(chǔ)。

這就提醒我們?cè)谧龌仡櫺缘难芯繒r(shí)一定要注意所使用的修復(fù)條件,它與新鮮標(biāo)本的修復(fù)條件一定是有所區(qū)別的,同等條件下一定要加長(zhǎng)修復(fù)的時(shí)間或提高修復(fù)所使用的溫度,才可能得到比較滿意的結(jié)果。

三、不同pH值抗原修復(fù)液對(duì)染色結(jié)果的影響

抗原熱修復(fù)中所使用的修復(fù)液pH值也會(huì)對(duì)染色結(jié)果產(chǎn)生相當(dāng)大的影響。

pH值對(duì)染色結(jié)果的影響大概可以分為以下四種情況:

A.穩(wěn)定型,pH值對(duì)染色結(jié)果影響不大,如PCNA、AE1、EMA、CD20等;

B.V型,高pH值和低pH值染色較好,而pH值4-5染色結(jié)果較差,如ER、Ki-67等;

C.上升型,隨著pH值的增加,染色結(jié)果逐漸增強(qiáng),如HMB45等;

D.下降型,隨著pH值的增加染色結(jié)果逐漸減弱,當(dāng)然這種類型的抗體只是個(gè)別的現(xiàn)象,如MOC31。

一個(gè)有趣的現(xiàn)象值得注意,即在高pH值都有較好的染色結(jié)果,所以目前比較推崇的抗原修復(fù)液為高pH值得修復(fù)液,如1mMEDTA, pH8.0或pH9.0等。但是由于傳統(tǒng)習(xí)慣,絕大多數(shù)醫(yī)院和實(shí)驗(yàn)室都在使用pH6.0的枸櫞酸緩沖液。綜合以上各種抗體的染色狀況,考慮到臨床工作的實(shí)際情況,許多國(guó)外免疫組化專家建議,在常規(guī)的免疫組化工作中,全部選用高pH值得修復(fù)液來代替目前廣為使用的pH6.0枸櫞酸緩沖液。為此,本公司已經(jīng)推出pH8.0和pH9.0的新型抗原修復(fù)液。經(jīng)驗(yàn)證,絕大多數(shù)的抗體使用pH9.0得修復(fù)液效果都要優(yōu)于pH6.0的枸櫞酸,尤其是核陽(yáng)性的抗體。所以,在常規(guī)的免疫組化工作中,使用高pH值的抗原修復(fù)液是今后的必然趨勢(shì)。

四、抗原熱修復(fù)的手段
表2 微波爐修復(fù)和高壓鍋修復(fù)的比較
  • 溫度
  • 壓力
  • 時(shí)間
  • 受熱
  • 微波爐
  • 100℃
  • 1P
  • 15~20分鐘
  • 不均勻
  • 高壓鍋
  • 120℃
  • 1.2P
  • 噴氣2分鐘
  • 均勻

目前抗原熱修復(fù)所采用的方法主要有微波爐修復(fù)和高壓鍋修復(fù)兩種,從“表2”中可以看出,由于高壓鍋修復(fù)具有溫度均一、節(jié)省時(shí)間、效果穩(wěn)定等特點(diǎn),已經(jīng)越來越受到人們的青睞。

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