CAOPORN成人免费公开,欧美FREESEX黑人又粗又大 ,欧美狠狠入鲁的视频777色,主仆调教SM束缚绳索捆绑

掃碼關(guān)注公眾號(hào)           掃碼咨詢技術(shù)支持           掃碼咨詢技術(shù)服務(wù)
  
客服熱線:400-901-9800  客服QQ:4009019800  技術(shù)答疑  技術(shù)支持  質(zhì)量反饋  人才招聘  關(guān)于我們  聯(lián)系我們
一本大道AV伊人久久综合,亚洲爆乳无码精品AAA片蜜桃,国产SUV精二区九色
Western Blotting 操作步驟
一、Western Blotting 實(shí)驗(yàn)步驟概述

1、 組織取材:組織塊稱重

2、 利用液氮、研缽粉碎組織塊

3、 加入RIPA緩沖液(每克組織3ml RIPA),PMSF(每克組織30μl,10 mg/ml PMSF),

利用Polytron進(jìn)一步勻漿(15,000轉(zhuǎn)/分*1分鐘)維持4℃

4、 加入PMSF(每克組織30μl,10 mg/ml PMSF),冰上孵育30分鐘

5、 移入離心管4℃,約20,000g(約15,000轉(zhuǎn))15分鐘

6、 上清液為細(xì)胞裂解液可分裝-20℃保存

7、 進(jìn)行Bradford比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度

8、 取相同質(zhì)量的細(xì)胞裂解液(體積*蛋白質(zhì)濃度),并加等體積的2×電泳加樣緩沖液

9、 沸水浴中3分鐘

10、上樣

11、電泳(濃縮膠20mA,分離膠35mA)

12、電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜(100mA 40分鐘)

13、膜用麗春紅染色,膠用考馬斯亮藍(lán)染色

14、Westernblot 試劑盒顯色

15、分析比較記錄

二、Western Blotting 具體實(shí)驗(yàn)步驟

Western,也稱Western blot、Western blotting、Western 印跡,是用抗體檢測(cè)蛋白的重要方法之一。

Western可以參考如下步驟進(jìn)行操作:

1、收集蛋白樣品(Protein sample preparation)

可以使用適當(dāng)?shù)牧呀庖毫呀赓N壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。對(duì)于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白,例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等,可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白,也可以使用試劑盒進(jìn)行抽提。

收集完蛋白樣品后,為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致,需要測(cè)定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同,需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y(cè)定方法。因?yàn)椴煌牡鞍诐舛葴y(cè)定方法對(duì)于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。如果使用北京博奧森生物技術(shù)公司生產(chǎn)的WIP細(xì)胞裂解液,可以使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒。

2、電泳(Electrophoresis)

(1)、SDS-PAGE凝膠配制

SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻(xiàn)資料進(jìn)行配制,也可以使用博奧森生產(chǎn)的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒。該試劑盒提供了除水和配膠器具外的所有試劑以及配制各種濃度SDS-PAGE的配方。

(2)、樣品處理

在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積,在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻(xiàn)資料配制,也可以使用博奧森生產(chǎn)的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X) 。100℃或沸水浴加熱3-5分鐘,以充分變性蛋白。

(3)、上樣與電泳

冷卻到室溫后,把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果,以及判斷蛋白分子量大小,最好使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。

電泳時(shí)通常推薦在上層膠時(shí)使用低電壓恒壓電泳,而在溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時(shí)使用高電壓恒壓電泳。對(duì)于Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置或類似電泳裝置,低電壓可以設(shè)置在80-100V,高電壓可以設(shè)置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求。為了電泳方便起見,也可以采用整個(gè)SDS-PAGE過程恒壓的方式,通常把電壓設(shè)置在100V,然后設(shè)定定時(shí)時(shí)間為90-120分鐘。設(shè)置定時(shí)可以避免經(jīng)常發(fā)生的電泳過頭。

通常電泳時(shí)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳,或者可以根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況,預(yù)計(jì)目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳。

3、轉(zhuǎn)膜(Transfer)

我們推薦在Western實(shí)驗(yàn)中選用PVDF膜。硝酸纖維素膜(NC膜)或PVDF膜(二氟化樹脂膜膜孔徑:0.45um)也可以使用,但硝酸纖維素膜比較脆,在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。膜的使用請(qǐng)參考生產(chǎn)商的推薦使用步驟。

通常如果使用Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置,可以設(shè)定轉(zhuǎn)膜電壓120V,轉(zhuǎn)膜時(shí)間為30-60分鐘。具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定,目的蛋白的分子量越大,需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長,目的蛋白的分子量越小,需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短。

在轉(zhuǎn)膜過程中,特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時(shí),通常會(huì)有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象,最好把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn),通常分子量最大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液對(duì)膜進(jìn)行染色,以觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜效果。也可以用考馬斯亮藍(lán)快速染色液對(duì)完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠進(jìn)行染色,以觀察蛋白的殘留情況。

4、封閉(Blocking)

轉(zhuǎn)膜完畢后,立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液中,漂洗1-2分鐘,以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟,一定要注意膜的保濕,避免膜的干燥,否則極易產(chǎn)生較高的背景。

用微型臺(tái)式真空泵吸盡洗滌液,加入Western封閉液,在搖床上緩慢搖動(dòng),室溫封閉60分鐘。對(duì)于一些背景較高的抗體,可以在4℃ 封閉過夜。

5、一抗孵育(Primary antibody incubation)

參考一抗的說明書,按照適當(dāng)比例用Western一抗稀釋液稀釋一抗。

用微型臺(tái)式真空泵吸盡封閉液,立即加入稀釋好的一抗,室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。如果一抗孵育一小時(shí)效果不佳,可以在4℃緩慢搖動(dòng)孵育過夜。回收一抗。加入Western洗滌液,在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后,再加入洗滌液,洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。

6、二抗孵育(Secondary antibody inucubation)

參考二抗的說明書,按照適當(dāng)比例用Western二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗。

用微型臺(tái)式真空泵吸盡洗滌液,立即加入稀釋好的二抗,室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。回收二抗,加入Western洗滌液,在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后,再加入洗滌液,洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。

7、蛋白檢測(cè)(Detection of proteins)

參考相關(guān)說明書,使用BeyoECL, Western 熒光檢測(cè)試劑等ECL類試劑來檢測(cè)蛋白。

洗片時(shí)可以使用X光片自動(dòng)洗片機(jī)。如果沒有自動(dòng)洗片機(jī),可以用顯影定影試劑盒自行配制顯影液和定影液進(jìn)行手工洗片。

8、膜的重復(fù)利用(Membrane recovery)

如果蛋白樣品非常寶貴,可以使用Western一抗二抗去除液處理蛋白膜,以重復(fù)利用蛋白膜。

三、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1、 把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上;

a. 轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜,將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上,用5ml移液管在凝膠上來回滾動(dòng)去除所有的氣泡

b. 在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙(預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕),將凝膠夾在中間,保持濕潤和沒有氣泡

c. 將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中,凝膠面向陰極

d. 將上述裝置放入緩沖液槽中,并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒凝膠

e. 按照廠家所示接通電源開始電泳轉(zhuǎn)移

f. 轉(zhuǎn)移結(jié)束后,取出薄膜和凝膠,棄去凝膠

2、 將薄膜漂在氨基黑中快速染色,直至分子量標(biāo)準(zhǔn)顯現(xiàn)時(shí)取出,記錄下標(biāo)準(zhǔn)位置;

3、 用100ml水洗滌纖維素膜,必要時(shí)可用脫色緩沖液;

4、 膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時(shí);

5、 室溫下,用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜

6、 用封口機(jī)將薄膜封入塑料袋中,盡可能不留空氣;

7、 袋的一角剪一緩沖液的小口,用透析袋夾緊;

8、 混合:NGS(100微升),印跡緩沖液中的抗體(2.5-5毫升),加在裝薄膜的袋中,于室溫下?lián)u動(dòng)2小時(shí)(或4℃過夜);

9、 用總體積300ml PBS-Tween緩沖液,分4次在一淺盤中洗滌薄膜,每次75ml;

10、將連接生物素的羊抗兔IgG(40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS)加在袋內(nèi),于室溫下?lián)u動(dòng)1小時(shí);

11、按步驟9洗滌;

12、加入抗生素蛋白-HRP(40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS),于室溫下?lián)u動(dòng);

13、Western Blot中轉(zhuǎn)移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài),空間結(jié)構(gòu)改變,因此那些識(shí)別空間表位的抗體不能用于Western Blot檢測(cè)。這種情況可以將表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞裂解液中的所有蛋白先生物素化,再用酶標(biāo)記親和素進(jìn)行Western Blot。實(shí)驗(yàn)中取膠和膜需帶手套。

四、關(guān)于內(nèi)參抗體

推薦產(chǎn)品:本公司自主研發(fā)的β-Actin肌動(dòng)蛋白(抗體),產(chǎn)品編號(hào):bs-0061R。

本公司的內(nèi)參抗體bs-0061R具有以下特點(diǎn)優(yōu)勢(shì):

1、經(jīng)親和層析純化的濃縮液(或凍干粉),該抗體質(zhì)量超過國外任何公司的同種產(chǎn)品;

2、用于Western Blotting為非常清晰的一條帶稀釋比達(dá)1:400;

3、用于免疫組化表達(dá)位置準(zhǔn)確,特異性強(qiáng)、效價(jià)高;

4、分子量:42Kda,根據(jù)需要可提供各種不同的包裝;

5、IgG含量為100μg/0.2ml 500ug/1ml;

6、價(jià)格僅為0.1ml/480.00元人民幣;

7、只需4℃保存運(yùn)輸,有效期:-20℃液體長達(dá)兩年(凍干粉狀態(tài)長達(dá)5年以上);

8、產(chǎn)品費(fèi)用低 ,性能穩(wěn)定、質(zhì)量可靠、易于保存;

9、該抗體適用廣泛,可用于人、羊、狗、豬、牛、兔、雞和大、小鼠等動(dòng)物種屬蛋白檢測(cè);

眾所周知,要用Western Blot比較不同條件下或者不同組織中,目的蛋白表達(dá)量的相對(duì)多少,前提條件是等量的蛋白上樣,才有比較的基礎(chǔ)。特別是在表達(dá)量不高時(shí),上樣量的差別就很可能影響結(jié)果的分析。所以需要內(nèi)參做對(duì)比。

內(nèi)參即是內(nèi)部參照(Internal Control),對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)來說一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白(Housekeeping Proteins),它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定,在檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平變化時(shí)常用它來做參照物。在Western Blotting 實(shí)驗(yàn)中,除了需要進(jìn)行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、轉(zhuǎn)膜、靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外,還需要進(jìn)行內(nèi)參的檢測(cè),以校正蛋白質(zhì)定量、上樣過程中存在的實(shí)驗(yàn)誤差,以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

在國外發(fā)表的文章中,Western Blotting 實(shí)驗(yàn)結(jié)果須進(jìn)行內(nèi)參校正已成為一種慣例。但是,國內(nèi)仍有不少科研人員在Western Blotting實(shí)驗(yàn)中忽略了內(nèi)參的使用,將蛋白濃度測(cè)定作為規(guī)范需相互比較的各種樣品間上樣量等同的唯一方法。然而各種蛋白質(zhì)濃度定量方法,都存在局限性,不能完全準(zhǔn)確的確定各種樣品的準(zhǔn)確蛋白濃度。 蛋白質(zhì)定量以后進(jìn)行電泳時(shí)需要等量上樣,此步驟也存在操作誤差。在Western blotting實(shí)驗(yàn)時(shí)使用內(nèi)參,即可簡便地對(duì)定量和上樣步驟產(chǎn)生的誤差進(jìn)行校正。此外使用內(nèi)參可以作為空白對(duì)照,檢測(cè)蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否完全、整個(gè)Western Blot顯色或者發(fā)光體系是否正常。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析其實(shí)很簡單:如果樣品蛋白量有限,只夠進(jìn)行一次電泳轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)時(shí),分別檢測(cè)樣品的內(nèi)參量和目的蛋白量。將各樣品目的蛋白量分別除以其內(nèi)參含量,得到的數(shù)值即為內(nèi)參校正后的各樣品中目的蛋白相對(duì)含量,再用此數(shù)值進(jìn)行樣品間的比較和分析,得到目的蛋白含量在不同樣品間的實(shí)際變化結(jié)果。如果樣品量充分,可以先檢測(cè)內(nèi)參,觀測(cè)樣品間內(nèi)參顯色條帶是否一致,根據(jù)差異大小調(diào)整各樣品的上樣量重新進(jìn)行Western Blotting實(shí)驗(yàn),至內(nèi)參量一致為止;若內(nèi)參一致,即可進(jìn)行不同樣品間目的蛋白表達(dá)變化分析。這樣雖然麻煩一點(diǎn),但是可以保證結(jié)果更有說服力,更可信。畢竟我們的實(shí)驗(yàn)是一種嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ鳌?/p>

五、實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的問題及處理辦法

1、為什么帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象?

原因:主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的;

處理辦法:加樣前離心,選擇適當(dāng)?shù)臉悠肪彌_液,加適量樣品促溶劑;電泳緩沖液時(shí)間過長,重新配制;降低凝膠濃度。

2、為什么帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象?

原因:主要是樣品不溶性顆粒引起的;

處理辦法:加樣前離心,加適量樣品促溶劑。

3、為什么電泳的條帶很粗?

原因:電泳中條帶很粗是常見的事,主要是未濃縮好的原因;

處理辦法:適當(dāng)增加濃縮膠的長度,保證濃縮膠貯液的pH正確(6.7),適當(dāng)降低電壓。

版權(quán)所有 2004-2026 www.www.tjshangbang.com 北京博奧森生物技術(shù)有限公司
通過國際質(zhì)量管理體系ISO 9001:2015 GB/T 19001-2016    證書編號(hào): 00124Q34771R2M/1100
通過國際醫(yī)療器械-質(zhì)量管理體系ISO 13485:2016 GB/T 42061-2022    證書編號(hào): CQC24QY10047R0M/1100
京ICP備05066980號(hào)-1         京公網(wǎng)安備110107000727號(hào)
欧美精品一区在线播放| 每日更新在线观看av| JAPONENSIS中国农村| 国内精品国语自产拍在线观看| 久久综合九色综合欧美狠狠| 欧美在线第一二三四区| 天干天干天啪啪夜爽爽色| 亚洲国产高清| 蜜臀AⅤ永久无码精品| 亚洲AV无码专区在线观看下载| 日本暖视频一区二区三区| 浪荡人妻共32部黑人大凶器电影| 少妇被躁爽到高潮无码人狍大战| 欧美顶级METART裸体全部自慰| 朋友的丰满人妻中文字幕| 成人网站在线进入爽爽爽| 人摸人人人澡人人超碰手机版| 成人福利国产午夜AV免费不卡在线| 伊人小蛇婷婷色香综合缴缴情| 亚洲色成人网站WWW永久四虎| 欧美日韩亚洲一区二区三区| 日韩高清欧洲亚洲欧美| 亚洲卡1卡2乱码新区仙踪| 精品久久久久久无码中文野结衣| 韩漫画免费阅读在线观看| 日本高清在线精品一区二区三区| 亚洲国产福利精品| 一本色道久久HEZYO无码| 欧美性生交XXXXX久久久| japanese色国产在线看视频| 人妻一区二区中文字幕| 国产精品日韩欧美在线第3页| 国产一卡2卡三卡4卡免费视频| 岳的下面又大又黑又肥| 色婷婷香蕉在线一区二区| 久久久久久久久麻豆| 日韩欧美二区在线观看| 精品多毛少妇人妻AV免费久久| 成全动漫视频在线观看免费高清| 中国大陆女rapper18岁欢迎您免费| 亚洲中文字幕无码AV永久|