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免疫組化操作流程
發(fā)表者：北京博奧森生物 發(fā)表時(shí)間：2016-2-15
（一） 儀器設(shè)備
1. 18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或用微波爐.
2. 水浴鍋
（二） 試 劑
1. PBS緩沖液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl 2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L,
KH2PO4 1.4mmol/L.
2．0.01mol/L檸檬酸鈉緩沖液（CB,ph6.0,1000ml）：檸檬酸三鈉3g,檸檬酸0.4g。
3．0.5mol/L EDTA緩沖液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA&
8226;2H2O,用10mmol/L
NaOH調(diào)至ph8.0,加水至1000ml.
4. 1mol/L的TBS緩沖液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris堿，用1N的HCl調(diào)至ph8.0,加水1000ml。
5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制
7. 風(fēng)裱劑：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（ph9.0–9.5）等量混合
b 油和TBS(PBS)配制
8．TBS/PBS PH9.0–9.5,適用于熒光纖維鏡標(biāo)本;ph7.0-7.4適合光學(xué)纖維標(biāo)本
（三） 操作流程
1 脫蠟和水化：脫蠟前應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘。 a 組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘,更換二甲苯后在浸泡10分鐘
b 無(wú)水乙醇中浸泡五分鐘
c 95%乙醇中浸泡五分鐘
d 75%乙醇中浸泡五分鐘
2 抗原修復(fù)：用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片：
A 抗原熱修復(fù)
a 高壓熱修復(fù) 在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸櫞酸鈉緩沖溶液（ph6.0）.蓋上不銹鋼鍋蓋，但不能鎖定。將玻片置于金屬染色加上，緩慢加壓，是玻片在緩沖液中浸泡五分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會(huì)升起來(lái)。10分鐘后除去熱源，置入涼水中，當(dāng)小閥門沉下去后打開(kāi)蓋子。此方法適用于較難檢測(cè)或核抗原的抗原修復(fù)。
b 沸熱修復(fù) 電爐或水浴鍋加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液（ph6.0）至95℃左右，放入組織芯片加熱10-15分鐘。
C 微波爐加熱 在微波爐里加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液（ph6.0）至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔5-10分鐘，反復(fù)1-2次。適用的抗原：
Bcl-2.Bax.AR.PR.C-fos.x-jum.z-kit.c-myc.E-cadherin.
ChromograninA.Cyclin.ER.Heatshock.Protein.HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等
B 酶消化方法
常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預(yù)熱37℃，消化時(shí)間約為5-30分鐘。適用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP.
Complement.Cytokeratin.C-erB-2.LCA.LN.等
3 免疫組化染色
SP法
（1） 脫蠟、水化 （2）PBS洗2-3次各5分鐘 （3）3%H2O2(80%甲醇)滴加在
TMA上，室溫靜置10分鐘 （4）PBS洗2-3次各5分鐘 （5）抗原修復(fù)
（6）PBS洗2-3次各5分鐘 （7）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體（8）滴加Ι抗50μl,室溫靜置1小時(shí)或4℃過(guò)夜或37℃1小時(shí)（9）4℃過(guò)夜后需在37℃復(fù)溫45分鐘（10）PBS洗3次每次2分鐘
（11）滴加Ⅱ抗45-50μl,室溫靜置或37℃1小時(shí)（12）Ⅱ抗中可加入0.05%的
tween-20.(13)PBS洗3次各5分鐘(14)DAB顯色5-10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度 （15）PBS或自來(lái)水沖洗10分鐘 （16）蘇木精復(fù)染2分鐘，鹽酸酒精分化（17）自來(lái)水沖洗10-15分鐘 （18）脫水、透明、封片、鏡檢。
SABC法
（1） 脫蠟、水化 （2）PBS洗2次各5分鐘 （3）用蒸餾水或PBS配制新鮮的3%H2O2，室溫封閉5-10分鐘，用蒸餾水洗3次（4）抗原修復(fù)
（5） PBS洗5分鐘 （6）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體（7）滴加Ι抗50μl,室溫靜置1小時(shí)或4℃過(guò)夜或37℃1小時(shí)
（8）PBS洗3次各2分鐘（9）滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20分鐘
（10）PBS洗3次各2分鐘 （11）滴加試劑SABC 20℃-30℃ 20分鐘
(12) PBS洗4次各5分鐘 (13) DAB顯色：試劑盒或自配顯色劑顯色
（14）脫水、透明、封片、鏡檢。
